有絲分裂誘導顯著的染色體壓縮，但在重新進入G₁期后染色體重新建立其間期組織。由于RNAP的藥理學抑制效率低下，德國哥廷根大學醫學中心和英國愛丁堡大學等合作研究團隊開發了允許生長素介導的人類細胞系，可以快速和可逆地消耗RNA聚合酶II(RNAPII) ，用以測試RNAPII在這種狀態轉變中的作用。原位Hi-C表明RNAPII是有絲分裂后compartment和loop建立所必需的。RNAP通常會抵消loo擠壓。如果沒有它會出現更長、更突出的loop。而來自染色質結合、超分辨率成像和計算模型的證據暗示這些效應是由于再進入G₁時RNAPII介導黏連蛋白加載。該研究利用多種組學技術，將RNAPII在基因表達中的作用與染色質結構中的作用協調展示。

（原文鏈接：https://www.science.org/doi/10.1126/sciadv.abg8205）

研究材料：人DLD-1結直腸癌系，大腸癌細胞系HCT116

研究方法：

• 測序技術：Hi-C，ChIP-seq，ATAC-seq，CUT&Tag，Factory RNA-seq（新生RNA水平）

• 定量、成像技術：蛋白質印跡，雙色超分辨率dSTORM熒光免疫技術，FACS分選，3D-DNA FISH

• 計算建模：HiP-HoP模型和ENCODE公共數據

1、RNAPII的嚴重缺失影響loop水平的染色質結構

RNAPII對細胞活力至關重要，其耗盡可能僅是瞬態的。研究者利用了人的DLD-1結直腸癌細胞系，它最大的RNAPII亞基RPB1是mAID結構域的N-端標記，可以添加生長素（和多西環素dox）以激活植物泛素連接酶TIR1來識別該mAID結構域，聯合蛋白質印跡評估、ChIP-seq（RPB1中mClover蛋白，RNAPII，H3K27ac，H3K27me3）、ATAC-seq和Factory RNA-seq確認dox/生長素處理后發生RNAPII的急性、可逆降解，并且還伴隨著染色質開放性劇烈減少，活性染色質顯著減少和兼性異染色質水平升高，>90%新生RNA下調且主要參與染色質組裝和基因表達調控。

圖1 生長素處理后發生RNAPII的急性可逆降解

隨后，研究者關注RNAPII耗竭時細胞間期染色質的空間結構變化，利用Hi-C技術分析有無生長素處理、以及在生長素基礎上補充轉錄抑制劑雷公藤內酯處理的G₁-sorted DLD-1–RPB1–mAID細胞，結合生長素/雷公藤內酯處理后增大的loop內累積新生RNA水平，結果顯示活性RNAPII可以抵消loop擠出，其去除會導致loop擴大。并且mAID-RPB1細胞在用生長素處理后染色質空間結構無變化，細胞間期急性RNAPII缺失時發生有微妙但可辨別的TAD和loop結構水平變化。

圖2 RNAPII耗竭時細胞間期染色質的空間結構變化

2、RNAPII是有絲分裂后重建空間染色質結構所需要的

RNAPII沒有顯著地影響異步細胞群中的間期染色質結構，研究者假設它可能與有絲分裂后重建染色質折疊有關。研究團隊為此使用CDK1抑制劑（阻斷約90% G₂細胞）在G₂-M checkpoint同步mAID-RPB1細胞，然后通過有絲分裂進入G₁并利用FACS分選得到G₁-reentry細胞。多種定量分析發現添加生長素確實發生RNAPII耗竭，H3K27ac水平降低，H3K27me3水平增加，同時SWI/SNF染色質重塑亞基改變，CTCF不變。接下來分析添加生長素RNAPII缺失后發生的染色質空間結構變化：

• 對用或未用生長素處理的G1-reentry細胞進行Hi-C，結合3D-DNA FISH證實RNAPII降解引起染色體間互作增強而染色體內互作減弱，compartment邊界模糊，A和B comptment之間>1Mb的互作更強。

• 10kb分辨率Hi-C分析，在生長素處理的細胞觀察到強烈且廣泛的domain結構、局部insulation和loop形成的缺失，邊界塌陷以及TAD合并。這與RNAPII和TAD邊界組蛋白標記的富集變化一致。

• RNAPII缺失引起的loop水平變化，大約有1900個丟失，同時出現>1150個新的和明顯更長的loop。

圖3 添加生長素RNAPII缺失后發生的染色質空間結構變化

3、拓撲異構酶II消耗不影響G₁-reentry期細胞的染色質折疊

考慮到拓撲異構酶（TOP2A/B）對RNAPII動態的局限影響，研究者想確定G₁-reentry細胞中TOP2缺失是否可以解釋RNAPII缺失所產生的影響，因而應用攜帶/未完全敲除TOP2B基因并純合表達mAID-tagged TOP2A的大腸癌細胞系HCT116。先驗證了生長素對TOP2A/B的降解作用，聯合FACS得到G1-reentry細胞，并分析新生RNA水平以及所有層級染色質結構的變化。多種數據分析表明RNAPII降解對染色質重折疊造成的影響無法由TOP2A/B降解概括，而是以聚合酶為中心。

4、RNAPII的去除會影響黏連蛋白在染色質的重新加載和loop形成

鑒于G₁-reentry細胞在RNAPII缺失時發生的loop變化以及影響loop形成的因素（CTCF錨定處的cohesin復合物和擠壓DNA），研究者利用多個分餾蛋白質印跡以及免疫熒光定量技術，檢查顯示CTCF、SMC1A或Rad21在生長素處理后reentry細胞中發生細小波動，兩個cohesin loader（NIPBL和MAU2）和黏連蛋白釋放因子（WAPL）的染色質結合水平則顯著降低。其后在有無生長素處理的G₁-reentry細胞中，利用超分辨率定位技術查看NIPBL和CTCF位置并結合染色質上NIPBL/MAU2/WAPL的水平變化，猜想黏連蛋白在沒有RNAPII的情況下加載異常（最有可能是從染色質釋放），并且CTCF結合位點的黏連蛋白減少。

圖4 RNAPII的去除會影響黏連蛋白在染色質的重新加載

因此，研究者在對照和生長素處理的reentry細胞中進行CUT&Tag（SMC1A和Rad21），發現CTCF位點的黏連蛋白信號在全基因組水平顯著降低，進一步量化CTCF結合區域、活性或非活性TSS和非RNAPII相關基因CUT&Tag信號以及Hi-C分析顯示，這種CTCF結合位點上黏連蛋白占有率的普遍減少損害了全基因組的loop形成。值得注意的是，此時ATAC-seq顯示CTCF近端可及性沒有降低。并且在RNAP耗盡的細胞中TSS的ATAC-seq信號和染色質上的TBP（TATA box–binding蛋白）水平增加，而RNAPII/SMC1A共占的TSS處CUT&Tag信號顯著降低，同時再次結合定量分析發現RNAP將黏連蛋白loader和釋放因子招募到這些位點，而在G₁-reentry細胞中建立TSS結構可能依賴于形成聚合酶前的“先鋒”因子（如TBP之類）。

圖5 RNAPII的去除會影響黏連蛋白在染色質的重新加載和loop形成

5、RNAP對loop擠壓的建模剖析

最后，該研究利用計算模型構建實驗難以挑戰的場景來剖析RNAPII和黏連蛋白重新加載到染色質上之間的聯系。主要是使用HiP-HoP模型調控多種情景下的三維染色質折疊，基于公共數據闡釋染色質的異常性質并整合TF結合和loop擠壓。通過多種參數調整，建模表明實驗中的主要染色質折疊差異可以通過RNAPII結合位點無法加載黏連蛋白來解釋，并且推斷出實驗中觀察到的效果可以通過RNAP占據位點的黏附蛋白與轉錄活性和loop擠壓之間的相互作用之間的簡單關系來說明。

圖6 建模剖析RNAP對loop擠壓的貢獻