系統性紅斑狼瘡（SLE）是一種復雜的自身免疫性疾病，其特點是自體抗體的產生、T淋巴細胞和B淋巴細胞的失調以及免疫復合物的形成，導致多器官損傷。SLE的發病機制在表觀遺傳學層面的研究十分廣泛，包括DNA甲基化、組蛋白修飾和非編碼RNA。不過，針對SLE患者的三維基因組研究很少，三維基因組改變與SLE疾病活動之間的關系以及三維基因組改變在自身免疫相關基因表達中的潛在調節作用仍待探究。
近日，中南大學湘雅二醫院皮膚科、中國醫學科學院皮膚病醫院陸前進教授與趙明教授合作以“3D genome alterations in T cells associated with disease activity of systemic lupus erythematosus”為題，在國際知名醫學雜志Annals of the Rheumatic Diseases（IF：27.97）發表了SLE研究成果。該研究結合Hi-C、RNA-seq、ATAC-seq motif富集分析和組蛋白修飾（H3K27ac, H3K4me1, H3K4me3）等信息，破譯了SLE患者T細胞的三維染色體結構，發現它與健康對照組顯著不同，并且與SLE的疾病活動密切相關。重要的是，該研究確定了與SLE的疾病活動和不同表達基因有關的染色質loop，以及靠近這些loop的一些關鍵組蛋白修飾，還證明了轉錄因子SPI1對干擾素通路基因過表達的調控貢獻，SPI1的motif位于SLE發生變化的loop中。此外，該研究還確定了遺傳變異對系統性紅斑狼瘡三維基因組改變的潛在影響。菲沙基因承擔了該研究中Hi-C等表觀多組學數據的部分分析工作。
圖1 文章信息
材料方案
研究材料：7個SLE患者和5個健康人的外周靜脈血，分選得到CD4+ T細胞
研究方法：
組學數據：Hi-C、ATAC-seq、ChIP-seq、RNA-seq
其他方法：qRT-PCR、CRISPR/Cas9、熒光素酶實驗、SPI1 siRNA轉染、3C-qPCR、ChIP-PCR
研究結果
1.CD4+細胞在SLE患者中的三維結構變化及其相關差異基因
首先，該研究在7名SLE患者和5名健康對照組（HC）外周血的CD4+T細胞進行Hi-C實驗，確定兩組對象的三維基因組結構，包括A/B compartment、TAD和loop結構。PCA分析顯示，在考慮每個SLE患者的SLE疾病活動指數（SLEDAI）情況下，12個人的TAD邊界和loop強度與其存在一定的規律。SLE疾病越重，SLE患者和HC在TAD邊界和loop強度的差異越大。
接下來，研究通過Hi-C測試的SLE樣本和HC樣本之間的基因表達（RNA-seq）確定差異表達基因（DEG）。DEG的GO富集有許多免疫功能，覆蓋了大約80%的DEG。從中提取免疫反應基因和囊泡基因，用于在所有樣本中通過PCA剖析與其重疊的TAD邊界或loop特征，結果進一步明確了這些基因的三維結構變化可以將SLE患者與HC區分開來，并且與SLEAI評分正相關。
圖2 12個樣本中免疫反應基因和囊泡基因相關TAD邊界和loop存在差異
2.391個與SLEDAI和不同表達基因相關的loop
SLEDAI相關loop和基因表達之間的關系可以通過交叉分析進行量化，研究確定有391個SLE相關的loop，它們的強度與SLEDAI和差異表達基因都有關聯。在所有樣本中，SLEDAI的變化與SLE相關loop強度變化存在一致性。功能富集和通路分析顯示，391個具有SLE相關loop的基因主要與炎癥和免疫相關的生物過程有關。例如流感感染、toll樣受體7/8或9信號傳導中TRAF6介導的IRF7激活、NLRP3炎癥體。不僅如此，SLE相關loop在所有樣本中擁有更大的長度，并且更多是長距離的TAD間loop，而這些SLE相關的TAD間loop是由TAD邊界周圍的弱絕緣分數決定的。
圖3 SLEDAI的變化與SLE相關loop強度變化存在一致性
在SLE loop相關基因表達的變化分析中，研究比較RNA-seq數據和已發表的CD4+T RNA-seq數據，分析SLE loop相關基因的相對表達并進行qRT-PCR驗證。結果顯示，與HC相比，SLE患者CD4+T細胞中DDX60L、LTBP1、CXCL13、SLC8A1、ATG5和IFIT1的表達明顯都上調，FCER1A和HDC的表達都下調。
圖4 SLE loop相關差異表達基因
3.SLE相關基因位點的三維結構變化
90%以上的SLE相關loop是基于增強子或啟動子的相互作用，研究重點關注SLE相關loop的基因位點時，觀察到有兩個SLE相關loop與DDX60L基因啟動子重疊。DDX60L是一個ATP依賴性的螺旋酶基因，參與先天免疫的IFN抗病毒反應。在DDX60L上，SLEDAI分數較高的SLE患者有更強的互作頻率。此外，患者的SLEDAI分數越高，該基因座的loop強度和基因表達也越強。熒光素酶報告實驗也顯示DDX60L啟動子區loop促進了其轉錄。此外，在DDX60L啟動子內，活性組蛋白標記H3K27ac、H3K4me1和H3K4me3在兩個loop錨點富集；SPI1是最常在兩個loop錨點富集的轉錄因子。當抑制SPI1表達時，DDX60L表達受到適度抑制，H3K4me3和H3K27ac水平也有所下降。在SPI1敲除的CD4+T細胞中進行ChIP-qPCR和3C-qPCR驗證時，SPI1能夠結合DDX60L的啟動子區域，轉染SPI1 siRNA使DDX60L啟動子的遠端loop互作減少。因此，在SLE患者的CD4+T細胞中，DDX60L基因座的轉錄調控是由SPI1、組蛋白修飾和染色質相互作用控制。
圖5 DDX60L基因座的轉錄調控是由SPI1、組蛋白修飾和染色質相互作用控制
已知SPI1與CD4+T細胞的Th9表型有關。Th9細胞和IL-9參與了SLE的發病機制。該研究中，Th9細胞相關基因（IL9、BATF、IRF1、ETV5、NFATC2和FOXO1）在SLE患者CD4+T細胞中的表達明顯上調。當在Th9細胞敲除SPI1時，IL9和BATF的表達明顯下降。此外，其他SLE相關的loop相關基因，如CXCL13、SLC8A1-AS1和DNAJB4，也表現出和DDX60L類似的模式-即患者的SLEDAI分數越高，基因座的loop強度和基因表達也越強。不過也有一些SLE相關loop并非如此，如CASP5附近的loop。
4.SLE相關SNP的三維結構變化
在SLE相關SNP的三維結構變化中，研究比較SLE患者和HC之間SNP位點的loop強度差異時，關注到了一個SLE相關的SNP，rs13385731。與HC相比，rs13385731區域的相互作用在SLE患者中有所增加。根據ENCODE的ChIP-seq（H3K4me1、H3K4me3和H3K27ac）的富集情況，該SNP位點與一個激活的增強子重疊。在SLE樣本中，攜帶rs13385731的增強子區域形成較長的互作loop，這可能影響LTBP1的局部染色質構象和基因表達。LTBP1是TGF-β途徑的一個組成部分，它與細胞外基質中的纖維蛋白-1結合以使TGF-β失活。
圖6 SLE相關SNP rs13385731的三維結構變化及特征
此外，rs2732549 SNP和APIP和SLC1A2在同一個TAD中，APIP和SLC1A2是SLE CD4+T細胞的DEG。這個TAD內有許多互作，APIP和SLC1A2附近存在強的增強子標記（H3K4me1和H3K27ac）。該區域是CD4+T/CD8+T細胞的超級增強子。另一個與SLE相關的SNP rs2245214，位于發生有遠距離互作的loop錨點。而SLE患者大多數遠距離相互作用都有所增加?？紤]到SNP rs2245214與參與自噬泡形成的基因ATG5重疊，這可能與SLE患者中ATG5過表達有關。
小 結
在該研究中，通過應用三維基因組和表觀遺傳方法分析了SLE中CD4+T細胞的三維基因組改變和轉錄調控機制，確定了差異表達基因的系統性紅斑狼瘡相關的loop。該研究繪制了SLE中發生了變化loop位點的三維基因組圖譜，并證實了轉錄因子SPI1在干擾素（IFN）-I途徑相關基因的潛在影響。
在本研究中，中南大學湘雅二醫院皮膚科趙明教授和馮德龍博士為共同第一作者，趙明教授和陸前進教授為共同通訊作者。菲沙基因劉琳博士署名參與了本研究。該工作得到了國家自然科學基金、CAMS創新工程基金、湖南省科技創新國際與區域合作重點項目和湖南省科技領軍人才項目的支持。
參考文獻：
Zhao M, Feng D, Hu L, et al. 3D genome alterations in T cells associated with disease activity of systemic lupus erythematosus[J]. Annals of the Rheumatic Diseases, 2022.
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