PacBio測序即單分子實時測序，其以SMRT Cell為載體進行測序反應，位于ZMW孔底部的熒光信號檢測區錨定了DNA聚合酶和一條DNA片段，并通過不同熒光標記的核苷酸及熒光激發的過程，將不同堿基的信號捕捉下來，從而得到DNA序列信息。

                SMRT cell                                            ZMWs                                              熒光基團

PacBio Sequel IIe

    與傳統的二代測序技術相比，三代PacBio測序技術具有超長讀長、無需擴增、無GC偏好性、可以直接檢測堿基修飾等優點，在科研與醫學相關領域得到廣泛應用。PacBio最新推出的Sequel II（Sequel IIe）測序平臺共有兩種測序模式，即CLR測序和HiFi測序。

    CLR測序模式稱為超長測序模式，其插入片段長度在30Kb以上，產生的數據是基于單循環測序的結果，一個插入片段只測序一次，準確率和PacBio 常規測序保持一致，在85%左右。CLR測序可以利用自身的數據進行糾錯，當數據深度達到 50X 左右時，一致性序列準確性超過99.999%（QV50）。

CLR 測序示意圖

    通過構建40Kb文庫，菲沙PacBio Sequel II平臺CLR測序最高產出達到220Gb，平均150Gb；Subreads 平均讀長20Kb，N50平均超過29Kb，具體見下表。

CLR下機數據統計表

    PacBio HiFi Reads是準確度超過Q20（>99%），并且還能兼顧超過10kb，甚至可達20 kb的長讀長測序模式。在HiFi測序模式下，酶讀長與CLR測序模式相當甚至更長（超過100 Kb），但插入片段只有10-20 Kb，因此測序時酶會繞著DNA模板（插入片段）進行滾環測序，即插入片段會被多次測序。這樣單次測序中造成的隨機測序錯誤，可以通過算法進行自我糾錯校正，最終得到高準確度的HiFi Reads。

HiFi測序示意圖

    通過構建15-20Kb的文庫，菲沙PacBio Sequel II平臺HiFi測序CCS原始數據超過500Gb，平均產出380Gb；HiFi最高產出38Gb，平均接近19Gb；HiFi平均讀長15Kb，N50接近17Kb，具體見下表。

HiFi下機數據統計表